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技术支持

仪器应用丨药物分析中薄层色谱的应用
发布时间:2018-09-25   点击次数:883次

薄层色谱(Thin Layer Chromatography,TLC)在药物尤其在植物药成分的定性和定量分析方面早已有了非常广泛的应用。随着科学技术的发展以及新材料的应用,使其得到了很大发展,出现了许多新技术,如薄层色谱、假相薄层色谱、反相薄层色谱、微乳薄层色谱在中药药物分析中已有一定的应用。TLC在规范化、仪器化方面均取得了长足的进步,在大批量样品及某些特殊样品的快速分析中,显示了分析容量大、可采用特征专属的显色剂以及极低的溶剂消耗等优势。
 

  近年来TLC广泛应用于有机化合物的分析鉴定、植物药有效部位的分离精制、有机合成、结构分析、生物测定等,尤其在研究开发植物药有效部位和中成药质量控制中,是用于定性、定量分析的zui简便的科学方法。但TLC亦有其缺陷,其色谱结果易受铺板质量、点样技术、展开剂配制、层析环境中展开剂的饱和度、环境温湿度等因素的影响,有时难于重复;显色又受均匀性、灵敏度、稳定性等影响,这均使测定结果偏差较大。zui近几年围绕着测定过程的标准化和自动化,薄层色谱技术有了全新的发展,扩大了TLC技术在中药药物定性定量分析中的应用。
 

  中药材的鉴别
 

  用薄层色谱进行指证性鉴别,它们之间的关系是共性与个性的关系。制备试药生药-共性化合物-共性特征(指示性的)薄层色谱个性化合物个性特征(Rf值、颜色)薄层色谱为生药提供了一个可信的“身份”,它可以提供分子水平上的鉴别作用,从而确定是不是认定的生药,是不是道地的生药,是不是已失效的生药。
 

  中华人民共和国药典2005版一部规定,人参和西洋参的鉴别必须使用薄层色谱法。取人参及西洋参粉末各19,制成供试品溶液;另取它们的对照药材19,同法制成对照药材试液,再取人参单体皂普Rbl、Re、Rgl、Rf和拟人参皂昔Fll制成对照品溶液,于同一硅胶G薄层板上进行色谱层析,规定供试品谱中,在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上,在日光及紫外光(365nm)下,分别显相同颜色的斑点或荧光斑点。在这里我们可以看到,人参分子特征是人参皂营单体,其伪品异类不具备这种分子个性特征,而且同属不同种的人参和西洋参分子特征亦不同,人参特含皂普Rf,而西洋参则特含拟人参皂昔Fll。这在某种程度上给我们规定了人参特征谱系。这种分子的不同、谱系的不同,就区别了药材的异同。
 

  在中成药及其复方制剂方面,赵志军等建立了益康胶囊的T LC 鉴别方法,对方中组成药物人参、黄芪、何首乌、丹参及甲基橙皮苷进行鉴别。结果,斑点清晰,分离效果好,专属性强,阳性对照无干扰。金阳研究破壁灵芝孢子粉胶囊的TLC 鉴别方法,通过对集中提取及展开系统的比较,对破壁灵芝孢子粉的鉴别选择GF254 板,用石油醚(60℃~ 90℃)-甲酸乙酯-甲酸( 15:5:1) 的上层溶液为展开剂。结果,鉴别效果好,能很好地把破壁灵芝孢子粉和灵芝区别开来。
 

  植物药成分的鉴别
 

  TLC 法在植物药成分鉴别方面的应用已极为广泛。印度M.S.大学的Murthy 等在2008 年报道了关于莕菜属植物中桦木酸的TLC检测方法,该方法将2.5g根粗粉用25mL甲醇溶液水浴加热回流提取30min,同法提取4 次后合并提取液,滤过、离心后制成一定浓度的甲醇溶液。将该样品溶液与桦木酸甲醇对照液同时在TLC硅胶G60 F254预制板上点样,用环己烷2醋酸乙酯2冰醋酸(7∶3∶0.03)溶剂系统展开,30 min后取出吹干,用茴香醛2硫酸溶剂喷淋,110℃加热3 min显色,斑点在紫外2可见光下检视,结果显示分离效果良好,Rf=0.60。该方法在桦木酸的检测方面以快速、简便、准确的特点优于其他方法。
 

  新德里生物技术研究所的Ram等在对多种药用植物的研究中建立了一种甲羟戊酸的快速TLC检测方法,实验对象包括黄花蒿、补骨脂、长春花、催眠睡茄、黄叶假杜鹃等药用植物的叶,方法采用硅胶G60 F254预制板,展开系统选用苯2丙酮(3:2),先将薄层板在甲醇中浸泡1h去除杂质,干燥后备用。粉碎的植物叶片用色谱纯醋酸乙酯提取,与对照品醋酸乙酯溶液同时点样展开,室温30℃,相对湿度55%,衍生试剂为0.05mL/mL茴香醛醋酸溶液-乙醇-97%硫酸(10:85:5),110℃下加热5 min显色。该方法简单、快速、灵敏度高。布达佩斯的Ligor等研究了多种茶叶中活性物质黄酮类的TLC检测方法,提出将经典液相萃取提取方法(LE)和超临界液体萃取法(SFE)作比较,并用TLC法检测在不同提取方法下活性成分的量。
 

  化学药品及复方制剂
 

  近年来TLC法以其快速、简便、准确的特点,在化学药物成分的研究中仍有很多应用。波兰J agiellonian大学的Starek等利用TLC法对抗炎药吡罗昔康的多种剂型及其降解产物进行了研究测定,其中,胶囊和注射剂用丙酮溶解,片剂在0.5mol/L的盐酸溶液中水浴加热至60℃,再制成丙酮溶液。该方法的展开系统为醋酸乙酯-甲苯-氨基丁烷(2:2:1),紫外吸收法测定检测波长360nm。研究结果表明,吡罗昔康的稳定性良好,不易降解,且在碱性环境下比酸性环境更稳定,其降解产物为嘧啶-2-胺和2-甲基-2,3-二氢-4 H-1 ,2-苯并噻唑-1 ,1 ,4-三酮。该方法稳定可靠,快速准确,可用于该类药物的分析鉴定。
 

  波兰Jagiellonian大学的Ekiert等用TLC测定唑类抗真菌剂,这是抗真菌唑类药物成分检测的新方法,目前鲜有报道。该实验对酮康唑、联苯苄唑、氟康唑和伊曲康唑4种抗真菌剂进行了测定,前3种用甲醇溶解定量,伊曲康唑用lv仿溶解,并制成甲醇溶液。经选择TLC板用硅胶60F254荧光板,展开系统选用正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水-冰醋酸(42:40:15:2:1),UV检测波长260nm。该法准确简便,专属性强,可作为抗菌素类药物TLC法研究的参考。
 

  药品的亲脂性是指某分子或分子的一部分对类脂环境的亲和性,有机化合物的亲脂性可以影响它们的吸收、分布、代谢和排泄等,所以药品的亲脂性研究对于药品的生物利用度的预测有着重要意义。传统的亲脂性研究是用液-液分配的方法测定,比较费时繁琐,反相TLC法亲脂性研究方法的引入解决了这一问题。
 

  Hamryt等用RP2TLC方法研究了12个精神类药物的亲脂性。选用Merck C18硅胶F254HPTLC薄层板(10cm×10cm),考察了多种流动相组合,结果表明zui好的流动相为:甲醇-水-0.01mol/L SDS-10%醋酸盐缓冲液(pH4.75)、醇-水-1%氨水、乙腈-水-1%氨水和二氧六环-水-1%氨水;而Cserely等用相对于反相TLC板便宜的石蜡油涂层的硅胶板研究了12种血管紧张素转化酶抑制剂(ACE)的亲脂性,其薄层板的制备方法为:TLC硅胶板用10%石蜡的正己烷溶液连续展开18h,以石蜡油饱和TLC硅胶颗粒涂层,板经干燥后在48 h内使用,流动相则选择不同比例的乙腈-水-氢氧化铵溶液,用样品的Rf值计算相应的亲脂性。
 

  药品杂质检验
 

  有关物质检查通常采用色谱法,可根据有关物质的性质选用专属性好,灵敏度高的薄层色谱,液相色谱(HPLC)及气相色谱(GC)法。薄层色谱法设备简单,操作简便,但因影响重现性和精密度的因素较多,可用作一般有关物质检查。采用反相薄层色谱法,建立了阿德福韦酷有关物质检查法。以反相F254薄层板(HPTLC RP18 F254)为吸附剂,以甲醇一水(3:1)为展开剂,在紫外光灯254nm下检视,阿德福韦醋与其有关物质的分离状况良好,检测灵敏度高,zui小检测限为0.1微克。采用薄层色谱法,建立了雌三醇栓中有关物质的检查方法,以硅胶G板为吸附剂,以lv仿-甲醇-丙酮-冰醋酸(9:0.5:0.5:0.5)为展开剂,展开后,晾干,喷以30%硫酸乙醇液,在100℃加热至斑点清晰。结果3种有关物质与原药完全分离,Rf值适中,zui低检出量为0.2pg,且重复性好。采用薄层色谱法检查复方氨酚烷胺颗粒中的有关物质(对lv苯乙酞胺),使用0.5%梭甲基纤维素钠(CMC)GF254硅胶板,以lv仿-丙酮-甲苯(13:5:2)为展开剂,紫外光灯254nm下检视,结果检出对lv乙酞胺杂质斑点与其它主药成分斑点分离良好,空白样品溶液的斑点对杂质斑点无干扰,重现性好,f值适中,能有效检出有关物质。
 

  中药指纹图谱分析
 

  中药指纹图谱可有效反映中药成分的复杂性,表征中药质量。其作为中药质量标准的一个方面,广泛用于鉴别样品的真伪或产地,有效成分研究等方面]。色谱法是中药指纹图谱的主流,主要有GC、HPLC、TLC等。TLC因其便宜、快速、开放性、灵活性等优点,用于中药指纹图谱分析。TLC的一大优势是提供直观形象的可见光或荧光图像,特征图像直观,专属性好,判断速度快,非常适合基层日常分析与现场检验使用。广藿香主要含萜类、黄酮类、醇、酸、铜、醛类等化合物,广藿香不同提取部位具有不同的药物效应。袁旭江等研究不同产地广藿香药材薄层色谱指纹图谱的差别,取不同产地广藿香样品6个,采用TLC检测其化学成分。结果,不同产地广藿香挥发油部位中成分薄层色谱行为相似,不同产地广藿香甲醇提取部位与石油醚提取部位成分则存在明显差异。薄层扫描仪具有原位扫描功能,通过测量薄层色谱Rf值,原位紫外-可见吸收光谱,结合板上化学特征反应形成薄层扫描中药指纹图谱。崔淑芬等使用薄层扫描法测定不同品种和产地的甘草并建立了指纹图谱,可快速判断药材品质,有效控制甘草质量。
 

  小结
 

  传统TLC技术由于精密度和重现性均较差,曾一度被其他快速发展起来的分离分析技术所取代,然而20 世纪80年代以来,随着薄层在色谱板、点样技术、展开技术方面的发展,薄层色谱的规范化和仪器化程度大大提高。加之直观、经济、简便的特点,将在中药多样品的分析中发挥更大的作用。

 

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